Asignaturas
Nueve NPSP masculinos (edad: 20 ± 2 años) fueron reclutados del mismo equipo de fútbol por el Servicio de Medicina Deportiva de Módena y realizaron sesiones de entrenamiento de fútbol por la noche. Todos los deportistas inscritos han obtenido un certificado de actividad futbolística competitiva del Servicio de Medicina Deportiva. Dicho certificado se emite después de un examen físico, evaluación de la historia clínica, un ECG en reposo y después de una prueba de esfuerzo. Los únicos criterios de exclusión fueron la presencia de enfermedades inflamatorias o lesiones ocurridas justo antes o durante el estudio.
Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones éticas de la Declaración de Helsinki, y el Comité de Ética del Área Vasta Emilia Nord aprobó todos los experimentos (protocolo número 88/2018/SPER/AUSLMO). Además, todos los participantes leyeron y firmaron un consentimiento informado.
Diseño
Este estudio observacional proporciona cinco sesiones consecutivas de WBC-t, administradas por las mañanas. WBC-t se realizó en una cámara Cryomed (Cryomed Italia, Milán, Italia) y consistió en una breve exposición (hasta 3 min) a aire extremadamente frío (-190° C) dentro de una cámara en la que las manos y la cabeza del sujeto permanecen afuera. , por lo tanto no en contacto con el estímulo frío. Los sujetos vestían ropa interior evitando la presencia de piezas metálicas. Se recolectó una muestra de 40 ml de sangre venosa de cada sujeto antes de la primera sesión de WBC-t (día 1) e inmediatamente después de la quinta y última WBC-t (día 5; Fig. 1).
Diseño del estudio. Representación esquemática del protocolo. Los iconos gratuitos utilizados en la figura están hechos por
Química clínica, hematología y análisis hormonales
Las muestras de sangre y orina de NPSP se recolectaron antes y después de WBC-t y se sometieron a varios análisis de laboratorio. La química clínica, hematología, parámetros hormonales y orina fueron evaluados en el Laboratorio BLU (NOCSAE, Baggiovara, Módena, certificación #ISO90012015) de acuerdo con el protocolo del hospital. En cuanto a las muestras de sangre, el Laboratorio BLU de Baggiovara evaluó un conjunto completo de cincuenta analitos, que incluyen glucosa, urea, creatinina, ácido úrico, colesterol, lipoproteína de alta densidad (HDL), lipoproteína de baja densidad (LDL), triglicéridos, bilirrubina T, bilirrubina D, proteínas T, transaminasa glutámico oxaloacética (GOT), transaminasa glutámico pirúvica (GPT), gamma-glutamil transferasa (GGT), CK, amilasa, sodio, potasio, hierro, transferrina, % de saturación, ferritina, fósforo, ácido láctico, Proteína C, proteína S, glóbulos blancos, glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), ancho de distribución de glóbulos rojos (RDW), plaquetas, volumen plaquetario medio (MPV), % y recuento de linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos y reticulocitos, hormona estimulante de la tiroides (TSH), T, C, hormona de crecimiento (GH), factor de crecimiento de insulina (IGF)-1, péptido C, insulina, hormona luteinizante (LH), folículo -hormona estimulante (FSH), estradiol (E2) y progesterona. Los analitos de química clínica se midieron en CoreLab en plataformas de química clínica completamente automatizadas, basadas en técnicas cinéticas enzimáticas de última generación, técnicas inmunoturbidimétricas, métodos colorimétricos (Chemistry AnalyzerS Olympus 680 y LX20, Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU. ). Se realizó hemograma completo con fórmula con tecnología Accucount para glóbulos rojos, blancos y plaquetas y tecnología VCS, conteo de triple impedancia, para fórmula de leucocitos y determinación espectrofotométrica de hemoglobina y reticulocitos (previa tinción con azul de metileno) (Analizadores de Hematología DXH 750 y DXH 800, Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). Las hormonas circulantes en sangre se detectaron en plataformas completamente automatizadas basadas en métodos CMIA (Analizador de inmunoensayo quimioluminiscente: Architect, Abbott Laboratories, Chicago, Illinois; EE. UU.; DXI, Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.; LiaisonXL, DiaSorin, Saluggia, Italia)”.
El análisis de orina evaluó la gravedad específica, el pH, la glucosa, las proteínas, la hemoglobina, las cetonas, la bilirrubina, el urobilinógeno, la esterasa leucocitaria y el nitrito. El análisis de orina se realizó mediante tira reactiva y captura de imágenes (Urine Microscopy System IQ200 sprint conectado al Urine Chemistry Analyzer iChem Velocity, Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.).
Procesamiento de sangre y análisis de plasma
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y el plasma se aislaron en nuestro laboratorio de la Universidad de Módena y Reggio Emilia a partir de sangre venosa mediante un método estándar de centrifugación en gradiente de densidad. Las PBMC viables se almacenaron en nitrógeno líquido y el plasma se almacenó a -80 °C hasta su uso. El análisis de plasma incluyó cuatro factores solubles (CCL-2, IL-2RA, IL-1RN e IL-18), extracción de ADN y posterior cuantificación del ADN mitocondrial circulante (mt) mediante PCR digital de gotas (ddPCR). El ADN se aisló de muestras de plasma con el QIAmp DNA Minikit, (Qiagen, Alameda, CA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNmt se cuantificó en un sistema de gotas Bio-Rad QX200 ddPCR, mediante el uso de ddPCR Supermix for Probes y el ensayo ddPCR para el gen ND2 de ADNmt (1 uL; UniqueAssayID: dHsaCPE5043508) y para el gen nuclear EIF2C1 (1 uL; UniqueAssayID: dHsaCP2500349 ). Los reactivos procedían de Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.
Los cuatro factores solubles CCL2, IL-18, IL-2RA e IL-1RA se analizaron a partir de muestras de plasma mediante el uso de ensayos Ella (Bio-Techne, MN, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. [23].